一氧化氮及两种细胞因子在分泌性中耳炎中耳积液中的表达及意义

第四军医大学西京医院耳鼻咽喉科   林国武　黄维国　姜鸿彦　王锦玲

摘　要：目的：探讨一氧化氮（NO）和白细胞介素-8(interleukin-8，IL-8)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)在分泌性中耳炎发生和转归中的作用。方法：检测58例(80耳)分泌性中耳炎患者血浆和中耳积液中NO 、IL-8及TNF-α，并用23例健康人血浆作对照。结果：NO、IL-8及TNF-α在中耳积液中阳性表达率分别为100%、82.2%和71.4%；患者组三者的血浆含量较对照组高(P<0.05)，中耳积液的含量较血浆中高(P <0.01)。病程短者IL-8含量高(P<0.01)；病程长者NO及TNF-α含量高(P<0.05)。浆液性 积液组IL-8含量高(P<0.01)；粘液性积液组NO及TNF-α的含量高(P＜0.05)。NO含量与TNF- α含量呈正相关。结论：NO、IL-8、TNF-α可能是中耳积液形成的诸多介质中的3种；IL-8在疾病早期参与机体的防御反应，促进浆液性中耳积液产生；NO和TNF-α与疾病的持续状态相关，并参与中耳积液中粘蛋白的分泌。

关键词：中耳炎，伴渗出液　一氧化氮　白细胞介素8　肿瘤坏死因子

　　 分泌性中耳炎是耳科常见病，发病机理虽有大量研究，但至今仍未能充分了解。近年来 一氧化氮（NO)和细胞因子在分泌性中耳炎发病机理中的作用日益引起人们重视。Rose等 ［1］ 通过小鼠中耳积液模型证实NO是产生中耳积液的重要介质；另一些学者［2，3］证实 中耳积液 中有白细胞介素(interleukin，IL)-1、IL-2、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子-α(tumor necr osis factor-α，TNF-α)、γ干扰素(interferon-γ，INF-γ)和粒细胞巨噬细胞集落 刺激 因子(granulocyte/macrophage colony stimulation factor，GM-CSF)的存在。NO的合成 受 多种细胞因子的影响，同时又影响多种细胞因子的分泌。我们通过测定患者中耳积液中的NO 、IL-8、TNF-α含量，比较它们在不同病程及不同性质积液中的水平，探讨它们在分泌性 中耳炎发生和转归中的作用。

材料与方法

　　一、研究对象

　　患者组为我科1998年1～6月门诊患者58例，其中男35例，女23例；年龄4～62岁，平均36.5岁；单耳36例，双耳22例，共80耳。发病时间2 d至3年。

　　对照组均系我院员工和家属，无中耳炎病史及全身系统疾病，共23例，其中男14例，女9例；年龄8～55岁，平均35.8岁。

　　二、标本收集、制备和检测方法

　　血浆标本采用抗凝静脉血3 ml，离心(2000 r/min, 15 min)，取上层血浆1 ml，中耳 积液标本在严格无菌下鼓膜穿刺抽出积液，均行封口、标记，存放-30℃冻存待测。

　　NO含量测定试剂盒由军事医学科学院放射医学研究所提供。按规定方法检测标本；采用上海第三分析仪器厂721分光光度计545 nm比色读吸光度(A)值，根据样品吸光度值，按标准曲线计算NO含量。

　　IL-8及TNF-α含量测定试剂盒均由第四军医大学免疫教研室提供，按酶联免疫吸附试验法测定，采用美国Syntron MPR2100 Elisa读数仪测410 nm处吸光度值，绘制标准曲线，根据样品吸光度值，计算IL-8和TNF-α含量。

　　当测得的含量大于最低标准含量时定为阳性(IL-8>0.156 ng/ml、TNF-α>0.156 ng/ml 、NO>0.138 μg/ml)。计算平均含量时包括低于最低标准含量的数值。
　　统计学处理采用t检验。

结果

　　1．均衡性检验：将患者组和对照组的年龄、性别等进行对比检验，差异均无显著性 ( P＞0.05)。

　　2．IL-8、TNF-α、NO在中耳积液标本中阳性表达率：NO为100%(60/60)，IL-8为82 .2%(37/46)，TNF-α为71.4%(30/42)。

　　3．患者组和对照组血浆中和中耳积液中NO、IL-8及TNF-α水平：3者在中耳积液的 含量明显高于同组血浆含量；而后者又明显高于对照组血浆含量，均有统计学意义(表1)。

表1　患者组与对照组NO、IL-8、TNF-α含 量比较(x±s)

    注：中耳积液测试NO、IL-8和TNF-α各为60、46和42耳。^*与对照组比较P＜0.05 ，^**与患者组血浆比较P＜0.01

　　4．病程与中耳积液NO、IL-8、TNF-α 3个因素的相关性分析，结果显示病程与IL-8 呈负 相关(r=-0.568，P＜0.01)，病程与NO呈正相关(r=0.345，P＜0. 05)，病程与TNF-α也呈正相 关(r=0.487，P＜0.01)。按病程长短将中耳积液分为两组，比较三者的差异 ，结果显示病程≤14 d者，IL-8含量高；病程≥28 d者NO和TNF-α含量高(表2)。

表2　病程与中耳积液中NO、IL-8、TNF-α 含量关系

    5．浆液性和粘液性中耳积液中3者的含量变化：发现浆液组IL-8含量高；粘液组NO 和TNF-α含量高(表3) 。 进一步分析NO和TNF-α的相关性，发现两者呈正相关(r=0 .696， P＜0.01)。

表3　浆液组与粘液组中耳积液中NO、IL- 8、TNF-α含量比较

讨论
　　NO是一氧化氮合酶催化L-精氨酸产生的氧化物，具有抗微生物效应，同时又是一种免 疫 调节剂，但过量的NO又往往促发免疫病理过程，介导某些细胞因子及炎症介质的产生而造成 组织损伤。IL-8是对炎症刺激作出应答反应的一种中性粒细胞活化肽［4］。TNF- α的主要生 物学活性包括激活炎性白细胞，诱导成纤维细胞增殖，抑制抗体形成，还能促进巨噬细胞释 放过氧化氢羟自由基，引起组织损伤。
　　中耳积液中NO、IL-8、TNF-α在不同病程阶段中含量不同，IL-8在早期高表达，NO 、TN F-α在晚期高表达，提示它们所起作用的不同。发病早期，局部产生较高含量的IL-1、IL -6 ［2，3］，IL-1可诱导巨噬细胞、单核细胞产生IL-8以趋化白细胞参与机体防御反 应，故IL-8 高表达；同时IL-6可抑制TNF-α产生［5］，IL-8的高表达也能抑制一氧化氮合酶 活性，减少 NO的合成，故NO、TNF-α表现为低表达。病变后期随着致病因素的减弱，IL-1、IL-6等 产生 减少，IL-6对TNF-α的抑制解除，TNF-α可出现高表达；TNF-α作为一氧化氮合酶的激 活剂，能增加NO的合成［6］，故NO的表达在病变晚期出现升高。
　　对早期中耳积液的分析发现大量中性多形核白细胞，其表面含有大量的IL-8受体 ［7］， 这种特异性可导致细胞变形、脱颗粒，释放溶酶体和过氧化物，造成咽鼓管及中耳粘膜水肿 ，增加毛细血管通透性，破坏粘液-纤毛输送系统，降低输送功能，使积液潴留于中耳腔内 。因此认为分泌性中耳炎早期中耳积液可能与IL-8的高表达直接相关。TNF-α被认为与疾 病 的持续状态相关，对渗出液的滞留起重要作用［2］。根据本实验所示，后期的NO和T NF-α均 出现高表达，推测NO和TNF-α的组织损害和抗体的抑制作用可能是导致分泌性中耳炎迁延 不愈的重要因素之一。
　　文献报道分泌性中耳炎的早期中耳积液中病原体的检出率显著高于后期［8］。 由于病理 因素的持续刺激，中耳粘膜发生一系列病理变化，杯状细胞增多，分泌粘蛋白形成粘液性积 液。Rose等［1］通过研究小鼠中耳积液模型的粘蛋白的分泌，认为细菌脂多糖首先 诱导TNF- α分泌，继而促进NO合成，NO通过升高粘膜上皮细胞内环磷酸鸟苷（cGMP）的浓度使粘蛋白 分泌增多。本实验结果显示NO和TNF-α在粘液性中耳积液中的高表达，且呈正相关关系， 与上述结果符合。
　　实验结果可以预见，NO抑制剂及激素的应用可能有助于减轻急性期的反应和慢性期粘蛋 白分泌及中耳粘膜的损害，有利于疾病的康复过程。

参考文献

［1］Rose AS, Prazma J, Randell SH,et al. Nitric oxide mediates mucin secretion in endotoxin-induced otitis media with effusion. Otolaryngol Head Neck Surg ,199 7,116:308-316.
［2］Yellon RF,Leonard G,Marucha P, et al. Characterization of cytokines present in middle car effusions.Laryngoscope, 1991,101:165-169.
［3］Yellon RF, Leonard G,Marucha P, et al.Demonstration of inter leukin 6 in middl e ear effusions. Arch Otolaryngol Head Neck Surg, 1992,118:745-748.
［4］Hotomi M,Samukawa T,Yamanaka N,et al. Interleukin-8 in otitis media with effusion. Acta Otolaryngol,1994,114:406-409.
［5］Aderka D,Le JM,Vilcek J, et al. IL-6 inhibits lipopolysacch aride-induced tumor necrosis factor production in cultured human monocytes,U937 cells,and in mice. J Immunol ,1989,143:3517-3523.
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［7］Leonard EJ,Skeel A,Yoshimura T, et al. Leukocyte specificity and binding of hu man neutrophil attractant/activation protein-1. J Immunol, 1990,144:1323-1330 .
［8］Jero J,Virolainen A,Salo P, et al. PCR assay for detecting Streptococcus pneum oniae in the middle ear of children with otitis media with effusion. Acta Otola ryngol, 1996,116:288-292.