丙型肝炎病毒非结构蛋白5A研究进展

    【关键词】   丙型肝炎 非法构蛋白 P56 P58

    丙型肝炎病毒（HCV）是输血后以及散发性肝炎的主要病原，其基因组全长9379-9481nt，依次为5′-UTR-C-E1-E2-P7-NS2-NS3-NS4A-NS5B-3′-UTR，内含一个开放读码框架（open reading frame，ORF），编码3010-3033个氨基酸的单一多聚蛋白前体，经宿主信号肽酶和病毒蛋白酶裂解为结构蛋白（C，E1，E2，P7）和非结构蛋白（NS2，NS3，NS4和NS5） ［1］ 。由于病毒非结构蛋白与病毒基因组的复制和表达、前体蛋白的加工成熟以及病毒的生命周期都有密切关系，因此，丙型肝炎病毒非结构蛋白的及基因成为研究的热点。NS5区可被NS3丝氨酸蛋白酶裂解为NS5A和NS5B两部分，NS5B区功能已明确为有RNA聚合酶活性，而其上游的NS5A区，由于它与干扰素治疗效果相关，而备受瞩目。最近发现NS5A区可发生适应性突变，使体外复制HCV成为可能，并作为进一步研究HCV复制机制和研制疫苗的重要工具。现就近年来有关NS5A基因的研究进展进行综述。

    1 HCV NS5A的基因定位及结构

    非结构基因NS5区位于基因组第6258-9374nt，由NS3丝氨酸蛋白酶裂解成NS5A和NS5B两部分，裂解位点位于cys-2420/ser2421间，不同HCV分离株的裂解位点及其侧翼序列相对保守。NS5A区位于6258-7601nt，编码1973-2420aa，蛋白的相对分子量为56KD（即P56）和58KD（即P58），P58是P56的过磷酸化形式，在NS3、NS4A和NS4B存在情况下，P56才能转变成P58 ［2］ 。过磷酸化位点为ser2197，ser2201和/或ser2204 ［3］ 。基础磷酸化位点位于NS5A区C端2200-2250处。大部分NS5A蛋白存在于细胞质中，位于内质网膜的细胞质侧 ［3］ 。NS5A的三维构象尚未明确定论。最近通过双预测法对全长NS5A序列进行二级结构的预测表明，疏水骨架可能是保守的，而其三维结构折叠也与基因型别无关 ［4］ 。黄病毒科成员NS5A蛋白的N端，其二级结构均具有明显的相似性 ［5］ 。NS5A三维结构的保守性，可能是维持其功能的保证。相比之下，那些通常位于蛋白表面的氨基酸 ［4］ ，如极性氨基酸和带电荷氨基酸常会发生变异，可能会影响NS5A蛋白与其它蛋白相互作用的能力，或者至少影响其在体内的活性。NS5A在HCV感染者体内呈现准种动态分布，因此在感染宿主细胞内可能存在不同功能的NS5A蛋白混合物。

    2 HCV NS5A的变异及干扰素疗效

    目前公认对丙型肝炎抗病毒治疗有效药物是干扰素（IFN），但HCV感染者对干扰素治疗的应答不一，平均应答率不足50%，且停药后复发率较高。影响干扰素疗效的因素众多，其中位于丙HCV非结构蛋白NS5A的第2209-2248位氨基酸序列与其干扰素疗效密切相关，称其为干扰素敏感决定区（ISDR） ［6］ 。与HCV-J相比，此区氨基酸的变异数大于4者，称为突变型;1～3个变异称为中间型;和HCV-J相同的序列，称为野生型。突变型HCV对干扰素治疗敏感，而野生型对干扰素有抗性，此在日本和西班牙的研究结果得到证实，而在欧美国家并未证明此相关性 ［7］ 。一项通过测定NS5A全序列的前瞻性研究表明，与IFN治疗相关的区域为NS5A C端的两个区域 ［7］ ，V3区和脯氨酸富集区。Gale等 ［8］ 应用ISDR缺失的突变体的研究发现，NS5A蛋白可抑制干扰素诱导的蛋白激酶（PKR）的活性，并且抑制真核生物转录起始因子2（eIF-2α）的磷酸化，从而阻止蛋白翻译的起始，其中ISDR是必需元件。部分解释了IS-DR对干扰素的抗性机制。

    3 HCV NS5A与病毒复制

    目前尚无直接证据表明NS5A在HCV复制中的确切作用。Blight KJ ［9］ 及其同事发现NS5A区存在适应性突变以来，为进行HCV的体外研究找到高效的细胞复制模型，同时也揭示出NS5A蛋白与复制的相关性。NS5A与NS5B在体外具有结合活性，同时NS5A以剂量依赖的方式调节NS5B的酶活性 ［10］ 。通过构建NS5A的缺失突变体M1LE/5Adel-1（不能与NS5B结合）、M1LE/5Adel-2（不能与NS5B结合），M1LE/5Adel-3（能与NS5B结合），分别转染Huh-7细胞，研究表明，只有M1LE/5Adel-3能促进复制，提示NS5A与NS5B的相互作用对于HCV的复制必不可少 ［11］ 。

    4 HCV NS5A与细胞凋亡

    抑癌基因P53是调节细胞生长和凋亡的关键蛋白，在人类肿瘤中该基因往往失活 ［12］ 。通过直接与病毒基因产物相互作用来调节P53活性，是多数具有转化能力和慢性化感染能力病毒的感染策略之一 ［13］ 。P53的靶基因之一是细胞周期依赖的蛋白激酶抑制剂P21/waf1，它调节成视网膜细胞瘤基因（RB蛋白）产物的磷酸化以及细胞周期G1向S的转变。有报导表明HCV NS5A可以下调P21的表达 ［14］ 。最近应用免疫共沉淀与激光共聚焦显微技术，发现P53与NS5A在体内共定位于宿主细胞核周围，推测NS5A抑制P21/waf1转录可能是通过直接与P53N端相互作用的结果，从而也抑制P53的转录 ［15］ 。乙型肝炎病毒（HBV）X蛋白也显示在细胞质与P53相互作用并将其挟持 ［16］ 。是否这是慢性肝炎病毒的通用法则尚不得而知。NS5A亦可能通过阻断P53介导的凋亡过程而间接促进肝细胞癌的发生。近来发现NS5A能够直接与磷脂酰肌醇-3激酶（phos-phatidylinositol3kinase，简称PI3K）P85调节亚基的Src同源性3结构域（Src homology3domain，简称SH3）相互作用，导致AKT/PKB（protein kinase B）磷酸化程度增加，从而使亚基因组复制子或单独表达NS5A的细胞系免于凋亡 ［17］ 。该结果表明NS5A可能是发展HCC的间接机制。

    5 HCV NS5A对转录的激活

    NS5A的转录激活作用的直接证据来自于酵母和HuH-7细胞系，研究者将NS5A的缺失突变体融合到GAL4DNA结合域 ［18］ 。N端截短的NS5A显示出最强的转录激活功能，其中心区域位于干扰素敏感决定区。全序列NS5A却无此转录活性。除干扰素敏感决定区之外，两个酸性氨 基酸区域和一个脯氨酸富集区也包括在内。与野生型干扰素敏感决定区相比，干扰素敏感型（有6个氨基酸的改变）的转录活性提高了90倍。说明突变可使转录活性增强。以上在体外获得的研究结果，在体内是否如此，有待于进一步研究。

    6 HCV NS5A调节宿主细胞内的钙水平

    最近研究表明，HCV NS5A能够改变细胞内的钙水平，诱导氧化应激和激活STAT-3和NF-κB ［19］ 。NS5A可使STAT-3组成型表达，抗氧化处理可使该效应逆转。由此提示，NS5A蛋白定位于内质网膜，钙从内质网中释放，到达线粒体，在线粒体内诱导活性氧粒子的形成，最终导致NF-κB的激活。用钙螯合剂或抗氧化剂可使NF-κB失活。将NS5A或整个非结构区转染细胞后，通过流式细胞检测分析发现，NS5A直接促进活性氧粒子的产生。NS5A激活NF-κB的活性可能具有抗凋亡效应，并且间接使肝细胞发生转化。因而NF-κB在慢性丙型肝炎肝脏中明显增加 ［20］ 。HCV转基因小鼠的研究显示，所有小鼠发生了脂肪变性，随后发展了肝细胞癌 ［21］ 。在这些HCV转基因小鼠肝脏中，发现活性氧粒子水平升高，因而可能是肝细胞癌发展的病因。

    7 HCV NS5A与细胞信号通路

    生长因子受体结合蛋白（growth factor receptor-bound protein2，Grb2）是介导细胞表面受体与下游蛋白之间信号转导通路的连接蛋白。NS5A C端包含脯氨酸富集序列（PXXP），与细胞内信号分子Src-3结合位点同源。应用免疫印迹法证实NS5A与Grb2在体内能相互作用，从而干扰感染细胞内正常的细胞信号转导通路，此可能为HCV致病的潜在机制 ［22］ 。NS5A-Grb2的结合抑制了胞外信号调节激酶（extracel-lular signal-regulated kinase，简称ERK）1和2的磷酸化，破坏了Grb-2介导的信号通路，从而抑制有丝分裂信号通路。不过NS5A并不影响Grb-2的水平。因而，NS5A要么干预有丝分裂信号通路，要么使Grb-2不能发挥其促凋亡功能 ［23］ 。此外，研究显示ERK信号级联反应可诱导IFN-α刺激的基因表达。因此NS5A可能通过与Grb-2相互作用部分抑制了IFN-α介导的抗病毒反应。然而，与内质网相关的NS5A如何介导抗病毒反应目前还不清楚。

    8 HCV NS5A诱导白介素-8，抑制干扰素-α的抗病毒反应

    白介素-8（IL-8）是一定的病毒感染细胞后产生的致炎趋化因子。研究表明HCV NS5A能够诱导（至少8倍）白介素-8的产生 ［24］ 。无论来自干扰素-α应答病人或无应答病人或是ISDR区缺失的NS5A，其诱导白介素-8的水平没有差异。在TNF-α存在情况下，除NS5A与IL-8启动子直接的相互作用外，NF-κB和AP-1对IL-8的诱导是也关键的。另外，体外生物检测发现，IL-8抑制干扰素-α的抗病毒水平大约可达12倍。这些实验结果表明，不仅NS5A诱导了IL-8的表达，而且IL-8能够抑制干扰素-α活性。最近发现IL-8水平与临床有一定的相关性。在132例HCV感染者中IL-8的水平明显高于健康对照（n=32） ［25］ 。前者IL-8的平均水平为1731±290pg/ml，而后者中仅为12.35pg/ml。治疗前的IL-8水平也与治疗的应答有关，治疗有应答、无应答与部分应答者的IL-8水平分别为（1606±773）pg/ml、（2727±951）pg/ml以及（2409±986）pg/ml。TNF-α是IL-8的强诱导剂，发现在HCV感染者中其水平明显升高（12.46±1.4）vs（6.11±3.3）pg/ml。最近对可能预测治疗持续应答的细胞因子谱系（TNF-α，IL-6，IL-8和IL-12）的分析表明，TNF-α水平在持续应答者中低于反跳或无应答患者 ［26］ 。在持续应答者中，TNF-α，IL-6，IL-12水平在治疗过程中均下降，但未发现细胞因子谱系与一定的治疗方案相关。

    9 小结

    总之，NS5A的功能至今仍不十分明确，近年来的研究表明其定位于内质网膜的细胞质侧，存在基础磷酸化与过磷酸化两种形式（P56和P58），与NS3、NS4B形成复制复合物调节NS5B的RNA聚合酶活性，从而调节病毒的复制水平。它所具有的抗凋亡功能、与PKR的结合活性、转录激活作用、干扰细胞内信号转导通路、诱导钙释放以及诱导IL-8的产生等多项生物学活性，提示其在病毒持续感染和肝细胞癌发生中可能具有重要作用。如果阻断上述NS5A的任一功能，便有可能改进对HCV感染的治疗效果。

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   作者单位:100011北京地坛医院传染病研究所